背景：

       科學(xué)研究表明，人體中存在的蛋白質(zhì)超過50%是以糖蛋白的形式存在。蛋白質(zhì)糖基化作為生物體內(nèi)最重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾形式之一，具有重要的生物學(xué)功能，不僅影響蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象、生物活性、運(yùn)輸及定位等，而且還參與分子識(shí)別、細(xì)胞通信、細(xì)胞分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫應(yīng)答等等在內(nèi)的各種重要生命活動(dòng)。在多種疾病，如腫瘤（FDA已批準(zhǔn)的用于癌癥疾病診斷和監(jiān)控的生物標(biāo)志物中大部分是糖蛋白）、神經(jīng)退行性疾病、心血管病、代謝性疾病、免疫性疾病及感染性疾病的發(fā)生發(fā)展中均伴隨著蛋白質(zhì)糖基化程度及糖鏈結(jié)構(gòu)異常的發(fā)生。此外，糖基化還顯著影響生物治療劑的生物活性、靶標(biāo)、運(yùn)輸、血清半衰期、清除率及受體識(shí)別等性質(zhì)。例如，重組促紅細(xì)胞生成素的藥代動(dòng)力學(xué)和效力受其糖基化狀態(tài)的嚴(yán)重影響，而單克隆抗體通過ADCC介導(dǎo)功效的能力受Fc區(qū)巖藻糖含量的影響，因此蛋白質(zhì)糖基化研究是繼核酸、蛋白質(zhì)之后生命科學(xué)中又一極具潛力的研究領(lǐng)域，具有重要理論及應(yīng)用意義。FDA要求所有類型的糖蛋白都需要進(jìn)行糖型分析。

       肽N-糖苷酶F（PNGase F，EC 3.5.1.52）是從糖蛋白中特異性除去N-連聚糖的糖苷內(nèi)切酶，是一類重要的糖基化研究的工具酶，被廣泛用于治療性蛋白質(zhì)上N-連糖鏈位點(diǎn)、結(jié)構(gòu)信息及功能關(guān)系的研究。Rhinogen^? PNGase F（Glycerol-free）是表達(dá)于大腸桿菌 BL21中的重組PNGase F，能夠?qū)⒔^大多數(shù)N-糖鏈（除含α-1,3連接的核心巖藻糖，常見于植物及昆蟲糖蛋白）完整地從其所連接的蛋白分子上釋放下來，可以在 N-連糖肽或糖蛋白的高甘露糖、雜合和復(fù)雜寡糖部分最內(nèi)側(cè)的 N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）和天冬酰氨殘基（Asn）之間進(jìn)行切割，釋放出完整的寡糖鏈，如圖1A。在釋放糖鏈的同時(shí)將氨基酸特征序列上的天冬酰胺殘基轉(zhuǎn)化為天冬氨酸殘基，其賦予蛋白質(zhì)+ 1Da質(zhì)量變化，如圖1B。它對(duì)多種底物具有高度活性，包括純化的糖蛋白和人血清糖蛋白的復(fù)合混合物。此外，由于不含甘油，在非變性條件下，酶與HPLC及質(zhì)譜工作流程環(huán)境兼容。連接到N-連寡糖的磷酸鹽，硫酸鹽和唾液酸基團(tuán)不影響N-糖鏈的釋放。

圖1A. PNGase F特異性切割位點(diǎn)；圖1B. PNGase F釋放糖鏈的反應(yīng)機(jī)制

產(chǎn)品包裝：

       Rhinogen^? PNGase F（Glycerol-free）包裝規(guī)格如下：

儲(chǔ)存體系：

       QPF-001儲(chǔ)存在緩沖液中，以液體的形式提供。緩沖液的組成為：50 mM NaCl，20 mM Tris-HCl (pH 7.5 at 25°C)，5 mM EDTA ，本品不含甘油，與下游HPLC、MS分析兼容。

配套試劑：

產(chǎn)品來源：

       Rhinogen^? PNGase F（Glycerol-free）是一種將PNGase F基因重組到pET28aT7啟動(dòng)子下游，并在大腸桿菌BL21中進(jìn)行表達(dá)后分離得到的重組糖苷酶，其分子量大小為36KDa。

產(chǎn)品質(zhì)量：

       SDS-PAGE分析，純度≥95%；沒有檢測(cè)到污染的外切糖苷酶、糖苷內(nèi)切酶及蛋白酶活性。

產(chǎn)品特性：

       最適反應(yīng)pH：7.5；熱失活條件：75°C處理10 min。

酶活定義：

       1個(gè)酶活力單位定義：在10 μl反應(yīng)體系中，37°C，pH7.5條件下，1小時(shí)內(nèi)催化釋放10μg變性RNase B＞95%N-連寡糖所需要的酶量。

       1U Rhinogen^? PNGase F=1 unit NEB PNGase F。不同公司產(chǎn)品的酶活力單位換算，請(qǐng)參考活力單位轉(zhuǎn)換表，如下： 

保藏條件：

       采用冰袋運(yùn)輸，收到產(chǎn)品后請(qǐng)立即將酶置于4℃，嚴(yán)禁凍存；配套試劑置于-20℃儲(chǔ)存。本品不含防腐劑，務(wù)必確保無菌操作取用，避免污染。 

應(yīng)用：

       1. 從糖肽及糖蛋白上釋放完整的N-連聚糖；

       2. 表征蛋白質(zhì)是否糖基化；

       3. 用于分子量檢測(cè)或晶體學(xué)研究時(shí)去糖基化蛋白質(zhì)的制備；

       4. N-糖基化糖蛋白的結(jié)構(gòu)-功能研究；

       5. 糖基化位點(diǎn)的確定。