背景：
科學(xué)研究表明，人體中存在的蛋白質(zhì)超過50%是以糖蛋白的形式存在。蛋白質(zhì)糖基化作為生物體內(nèi)最重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾形式之一，具有重要的生物學(xué)功能，不僅影響蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象、生物活性、運輸及定位等，而且還參與分子識別、細(xì)胞通信、細(xì)胞分化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫應(yīng)答等等在內(nèi)的各種重要生命活動。在多種疾病，如腫瘤（FDA已批準(zhǔn)的用于癌癥疾病診斷和監(jiān)控的生物標(biāo)志物中大部分是糖蛋白）、神經(jīng)退行性疾病、心血管病、代謝性疾病、免疫性疾病及感染性疾病的發(fā)生發(fā)展中均伴隨著蛋白質(zhì)糖基化程度及糖鏈結(jié)構(gòu)異常的發(fā)生。此外，糖基化還顯著影響生物治療劑的生物活性、靶標(biāo)、運輸、血清半衰期、清除率及受體識別等性質(zhì)。例如，重組促紅細(xì)胞生成素的藥代動力學(xué)和效力受其糖基化狀態(tài)的嚴(yán)重影響，而單克隆抗體通過ADCC介導(dǎo)功效的能力受Fc區(qū)巖藻糖含量的影響，因此蛋白質(zhì)糖基化研究是繼核酸、蛋白質(zhì)之后生命科學(xué)中又一極具潛力的研究領(lǐng)域，具有重要理論及應(yīng)用意義。FDA要求所有類型的糖蛋白都需要進(jìn)行糖型分析。
肽N-糖苷酶F（PNGase F，EC 3.5.1.52）是從糖蛋白中特異性除去N-連聚糖的糖苷內(nèi)切酶，是一類重要的糖基化研究的工具酶，被廣泛用于治療性蛋白質(zhì)上N-連糖鏈位點、結(jié)構(gòu)信息及功能關(guān)系的研究。Rhinogen? PNGase F（Glycerol-free）是表達(dá)于大腸桿菌 BL21中的重組PNGase F，能夠?qū)⒔^大多數(shù)N-糖鏈（除含α-1,3連接的核心巖藻糖，常見于植物及昆蟲糖蛋白）完整地從其所連接的蛋白分子上釋放下來，可以在 N-連糖肽或糖蛋白的高甘露糖、雜合和復(fù)雜寡糖部分最內(nèi)側(cè)的 N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）和天冬酰氨殘基（Asn）之間進(jìn)行切割，釋放出完整的寡糖鏈，如圖1A。在釋放糖鏈的同時將氨基酸特征序列上的天冬酰胺殘基轉(zhuǎn)化為天冬氨酸殘基，其賦予蛋白質(zhì)+ 1Da質(zhì)量變化，如圖1B。它對多種底物具有高度活性，包括純化的糖蛋白和人血清糖蛋白的復(fù)合混合物。此外，由于不含甘油，在非變性條件下，酶與HPLC及質(zhì)譜工作流程環(huán)境兼容。連接到N-連寡糖的磷酸鹽，硫酸鹽和唾液酸基團(tuán)不影響N-糖鏈的釋放。
圖1A. PNGase F特異性切割位點；圖1B. PNGase F釋放糖鏈的反應(yīng)機制
產(chǎn)品包裝：
Rhinogen? PNGase F（Glycerol-free）包裝規(guī)格如下：
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目錄號 |
規(guī)格 |
濃度 |
|
QPF-001-A |
15,000U/30μl |
500,000U/ml |
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QPF-001-B |
5×15,000U/30μl |
500,000U/ml |
儲存體系：
QPF-001儲存在緩沖液中，以液體的形式提供。緩沖液的組成為：50 mM NaCl，20 mM Tris-HCl (pH 7.5 at 25°C)，5 mM EDTA ，本品不含甘油，與下游HPLC、MS分析兼容。
配套試劑：
| 試劑 | 成分 |
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10×Denaturing緩沖液 |
5%SDS, 0.4M DTT |
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10×Glyco緩沖液2 |
0.5M Sodium Phosphate(pH7.5 at 25°C) |
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10%NP-40溶液 |
10%NP-40 |
產(chǎn)品來源：
Rhinogen? PNGase F（Glycerol-free）是一種將PNGase F基因重組到pET28aT7啟動子下游，并在大腸桿菌BL21中進(jìn)行表達(dá)后分離得到的重組糖苷酶，其分子量大小為36KDa。
產(chǎn)品質(zhì)量：
SDS-PAGE分析，純度≥95%；沒有檢測到污染的外切糖苷酶、糖苷內(nèi)切酶及蛋白酶活性。
產(chǎn)品特性：
最適反應(yīng)pH：7.5；熱失活條件：75°C處理10 min。
酶活定義：
1個酶活力單位定義：在10 μl反應(yīng)體系中，37°C，pH7.5條件下，1小時內(nèi)催化釋放10μg變性RNase B＞95%N-連寡糖所需要的酶量。
1U Rhinogen? PNGase F=1 unit NEB PNGase F。不同公司產(chǎn)品的酶活力單位換算，請參考活力單位轉(zhuǎn)換表，如下：
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Enzyme |
Company |
Selling Conc. (U/ml) |
Units /Vial |
μl /Vial |
Rhinogen? Assay (U/ml) |
Rhinogen? Assay Units /Vial |
μl Conversion (1Rhinogen?μl = x Company μls) |
|
PNGase F
|
Rhinogen? （QPF001/ QPF-002） |
500,000 |
15,000 |
30 |
500,000 |
15,000 |
1 |
|
NEB (NEB #P0708) |
500,000 |
15,000 |
30 |
500,000 |
15,000 |
1 |
|
|
Prozyme (GKE-5006A) |
2.5 |
0.1 |
40 |
150,000 |
6,000 |
3.3 |
|
|
Prozyme (GKE-5020B, Ultra) |
10 |
0.4 |
40 |
500,000 |
20,000 |
1 |
|
|
QA Bio (E-PNG01) |
5 |
0.3 |
60 |
200,000 |
12,000 |
2.5 |
|
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Sigma (P7367) |
500 |
50 |
50 |
90,000 |
4,500 |
5.5 |
保藏條件：
采用冰袋運輸，收到產(chǎn)品后請立即將酶置于4℃，嚴(yán)禁凍存；配套試劑置于-20℃儲存。本品不含防腐劑，務(wù)必確保無菌操作取用，避免污染。
應(yīng)用：
1. 從糖肽及糖蛋白上釋放完整的N-連聚糖；
2. 表征蛋白質(zhì)是否糖基化；
3. 用于分子量檢測或晶體學(xué)研究時去糖基化蛋白質(zhì)的制備；
4. N-糖基化糖蛋白的結(jié)構(gòu)-功能研究；
5. 糖基化位點的確定。
說明書
COAs
MSDS